報告基因（Reporter Gene）：通常指可編碼某種蛋白或酶，其表達產(chǎn)物容易被檢測，并且能與內源性背景蛋白相區別的基因，通過(guò)它的表達產(chǎn)物來(lái)標定目的基因的表達調控。
熒光素酶報告基因是指以熒光素(luciferin)為底物來(lái)檢測螢火蟲(chóng)熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過(guò)程中，會(huì )發(fā)出生物熒光(bioluminescence)；
一、原理簡(jiǎn)述
（1）構建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。
（2） 將要檢測的轉錄因子表達質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉染293細胞或其它相關(guān)的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì )表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。
（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產(chǎn)生熒光，通過(guò)檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。
二、技術(shù)流程
（1） 用生物信息學(xué)方法分析并預測啟動(dòng)子區可能的轉錄因子結合位點(diǎn)。
（2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。
（4） 擴增轉錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時(shí)準備相應的空載質(zhì)粒對照，提純備用。
（5） 培養293（或其它目的細胞），并接種于24孔板中，生長(cháng)10-24小時(shí)（80%匯合度）。
（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測。
（9） 計算相對熒光強度，并與空載對照比較。
綠色熒光蛋白的發(fā)光原理
GFP的第65至67位的三個(gè)氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸）殘基，可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團。當蛋白質(zhì)鏈折疊時(shí)，這段被深埋在蛋白質(zhì)內部的氨基酸片段，得以“親密接觸”，導致經(jīng)環(huán)化形成咪唑酮，并發(fā)生脫水反應。在分子氧存在的條件下，發(fā)色團可進(jìn)一步發(fā)生氧化脫氫，最終成熟，形成可發(fā)射熒光的形式。具體過(guò)程為：在 O2存在下，GFP分子內第67位甘氨酸的酰胺對第65位絲氨酸的羧基進(jìn)行親核攻擊，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應之后，導致芳香團與咪唑基結合，并最終自發(fā)催化形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色。
GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強還原劑能使GFP轉變?yōu)榉菬晒庑问?，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢復。一般來(lái)說(shuō)弱還原劑并不會(huì )影響GFP熒光，中度氧化劑如生物材料的固定，脫水劑戊二酸或甲醛等對GFP熒光影響也不大。
綠色熒光蛋白的發(fā)光特性
GFP吸收的光譜最大峰值為395nm（紫外），并有一個(gè)峰值為470nm的副吸收峰（藍光）；發(fā)射光譜最大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側峰（Shouder）。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發(fā)光對細胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。此外，GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）很相似，兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強，特別是在450～490nm藍光波長(cháng)下更穩定。類(lèi)似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高，抗光漂白能力強，因此更適用于定量測定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應底物，因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類(lèi)報告蛋白無(wú)法比擬的。但因為GFP不是酶，熒光信號沒(méi)有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類(lèi)報告蛋白，比如螢火蟲(chóng)熒光素酶等。
