一、假病毒簡(jiǎn)介

慢病毒：慢病毒（Lentivirus，LV）是以HIV-1（人類(lèi)免疫缺陷I型病毒）為基礎發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，屬于逆轉錄病毒，區別一般的逆轉錄病毒載體，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類(lèi)型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，因此具有廣闊的應用前景。

腺病毒：腺病毒(Adenovirus，ADV)是一種沒(méi)有包膜的直徑為70～90 nm的病毒顆粒，具有較強的細胞和組織感染能力，腺病毒載體能夠攜帶大容量的基因片段，適用于短時(shí)間內高表達的相關(guān)實(shí)驗，可以快速獲得目的產(chǎn)物，效率高。

腺相關(guān)病毒:腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）,也稱(chēng)腺伴隨病毒,屬于微小病毒科依賴(lài)病毒屬,是目前發(fā)現的一類(lèi)結構最簡(jiǎn)單的單鏈DNA缺陷型病毒，需要輔助病毒（通常為腺病毒）參與復制。研究過(guò)程中采用的重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV) 源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細胞范圍廣(分裂和非分裂細胞)、免疫源性低，在體內表達外源基因時(shí)間長(cháng)等特點(diǎn)，被視為最有前途的基因轉移載體之一，在世界范圍內的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應用。

二、慢病毒的儲存和稀釋

 1：儲存條件：-80℃可保存12個(gè)月左右，如果超過(guò)12個(gè)月，則病毒滴度下降可能較多，最好再使用前重新做滴度測定。4℃一般可儲存1-2周。注意：慢病毒使用時(shí)要注意避免反復凍融，如需要多次使用，請將病毒分裝后儲存在-80℃。

2：慢病毒稀釋?zhuān)涸谑褂们?，將慢病毒冰浴融化?/span>4℃冰箱融化，融化后放置在冰盒上備用。用完全培養基或

PBS稀釋。稀釋后的病毒請立即使用，不建議再分裝凍存。

3：泰斯拓生物提供的慢病毒滴度單位為TU/ml，即每毫升慢病毒液中含有具有生物活性的慢病毒顆粒數。“TU”為“Transducing-Units”的縮寫(xiě)，中文為轉導單位，表示可以感染并進(jìn)入到目標細胞群中的病毒基因組數。如：病毒滴度為1×108TU/ml，即每毫升病毒液中含有1×108個(gè)具有生物活性的病毒顆粒。

三、特殊細胞感染注意事項

1：懸浮細胞

懸浮細胞感染可以采用離心感染法，在培養皿中加入病毒后，可以將培養板子密封，然后使用水平轉子1000g離心1h，再放回培養箱中培養，這樣可以增加病毒與懸浮細胞的接觸概率，從而提高感染效率。

2：極難感染的細胞

有些細胞很難感染，那么單次感染之后的效率很低的情況下，可以采用多次反復感染的方法來(lái)提高感染效率，即在進(jìn)行一次感染之后，重新加入新鮮病毒再次感染，一般在加強感染之后，可以顯著(zhù)提高細胞的感染效率。但在兩次感染之間，要注意調整好細胞狀態(tài)，因為病毒在感染細胞之后是存在細胞毒性的，會(huì )影響細胞的生長(cháng)狀態(tài)。

3：原代細胞

對于原代細胞，一般細胞生長(cháng)比較緩慢，且其傳代能力較差，所以在接種的時(shí)候，可以提高細胞密度在50%以上。

4：非分裂細胞

對于一些非分裂細胞，其復蘇或接種后細胞不再分裂增殖，所以在進(jìn)行感染時(shí)，細胞的密度得在80%以上，所以在復蘇或者接種時(shí)就得注意把細胞密度鋪在80%以上。

最適MOI預實(shí)驗

5：貼壁細胞

（1）感染前一天，用胰酶消化目的細胞并計數，然后將細胞接種到96孔板，培養基體積為100µl，使得第二天進(jìn)行病毒感染時(shí)的細胞匯合度20-30%左右。對于大部分細胞，我們通常認為培養24h后細胞數量是鋪板數量的兩倍。

（2）MOI值的設置若有文獻參考，可以參考值為中心設置梯度覆蓋參考值；若無(wú)文獻參考可按照MOI 1，10，50，100設置MOI梯度進(jìn)行摸索。

（3）根據細胞數，按照MOI 1，10，50，100計算出需要加入的病毒滴度（最適MOI預實(shí)驗一般選用熒光對照病毒），然后使用含有終濃度為8ug/ml左右的polybrene（Cat.TA003）的完全培養基在對應的EP管里進(jìn)行稀釋?zhuān)傮w積為100µl。吸掉各孔中上清液，更換為稀釋好的不同MOI的病毒液，混勻，繼續培養。感染后24h后用完全培養基進(jìn)行換液，過(guò)程中觀(guān)察細胞形態(tài)，發(fā)生變化時(shí)可以提前到8h換液，保持細胞正常生長(cháng)。

（4）感染后約72h，觀(guān)察感染效率。根據后續實(shí)驗內容，選擇合適時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗?？砂凑諏?shí)際感染情況，校正MOI。

（5）最適MOI的選擇原則：1）：細胞狀態(tài)不受影響，2）：盡量用較少的病毒，3）：選擇感染效率80%左右的感染條件作為最佳感染條件。

6：懸浮細胞

（1）感染前一天，制備懸浮細胞懸液，細胞密度約為1*10^5個(gè)/ml將細胞接種到96孔板。

（2）MOI值的設置若有文獻參考，可以參考值為中心設置梯度覆蓋參考值；若無(wú)文獻參考可按照MOI 1，10，50，100設置MOI梯度進(jìn)行摸索。

（3）根據細胞數，按照MOI 1，10，50，100計算出需要加入的病毒滴度（最適MOI預實(shí)驗一般選用熒光對照病毒），然后使用含有終濃度為16µg/ml左右的polybrene（Cat.TA003）的完全培養基在對應的EP管里進(jìn)行稀釋?zhuān)傮w積為100µl。然后將不同MOI的病毒稀釋液加到對應的96孔中，混勻，繼續培養。感染后24h后再加入100µl完全培養基，以保持細胞正常生長(cháng)，過(guò)程中觀(guān)察細胞形態(tài)。

（4）感染后約72h，觀(guān)察感染效率。根據后續實(shí)驗內容，選擇合適時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗?？砂凑諏?shí)際感染情況，校正MOI。

（5）最適MOI的選擇原則：1）：細胞狀態(tài)不受影響，2）：盡量用較少的病毒，3）：選擇感染效率80%左右的感染條件作為最佳感染條件。